Decapitação: Anestesia prévia não é recomendada, uma vez que envolve maior manipulação e mais estresse para o animal. Outros métodos para a eutanásia são mais aceitáveis. Deve ser utilizado material específico como a guilhotina. Vale salientar que o sangue coletado após a decapitação frequentemente apresenta-se contaminado por secreções salivares e respiratórias.
A decapitação é aceita condicionalmente para pequenos roedores e aves. Ela é comumente usada quando os métodos químicos interferem com os resultados da pesquisa, porém, somente é recomendada quando a sua necessidade é justificada. Este método pode ser usado para eutanásia de roedores com menos de 200 g e coelhos jovens com menos de 1 kg, tão somente em situações de pesquisa, por permitir recuperar tecidos e fluidos corporais que podem ser alterados com uso de substâncias anestésicas. Guilhotinas são projetadas especificamente para esta finalidade e devem ser inspecionadas com frequência quanto a sua efetividade e a manutenção preventiva deve ser adequada. O tempo residual da atividade elétrica cerebral após a decapitação é assunto de intensos debates na literatura. Os relatos variam de parada imediata a 14 segundos de atividade elétrica após a decapitação. Como vantagens deste método destacam-se a rápida perda de consciência e a ausência de alterações químicas decorrentes do uso de métodos químicos para a eutanásia. Como desvantagens há o risco de falha por falta de manutenção do equipamento ou falha operacional e a percepção negativa para observadores. Outro fator a ser levado em consideração é o estresse dos animais pela manipulação. O uso da anestesia anterior à decapitação deve sempre ser considerado e pode tornar o método esteticamente mais aceitável.